酶底物法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌方法研究
铜绿假单胞菌,又称绿脓杆菌,属于假单胞菌属,是一种重要的食源性和水源性致病菌,在水中分布广泛,在特定情况下可引起呼吸系统、泌尿系统和胃肠道等多种急性和慢性感染及败血症。国家标准《食品安全国家标准 包装饮用水》(GB 19298-2014)规定,包装饮用水中铜绿假单胞菌不得检出。然而,研究表明,市售包装饮用水中铜绿假单胞菌的污染屡见不鲜,因此,有效监控包装饮用水中铜绿假单胞菌对于保障居民饮水安全有重要意义。
目前,铜绿假单胞菌国内检测标准是《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》(GB 8538—2016),此方法为滤膜法,但在实际应用中存在检测周期长、操作过程复杂等局限性。我公司第一个成功申请并发布的团体标准《包装饮用水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法》(T/HBFIA 0026—2021),可在24h内定性或定量检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌,操作简单,无需确认实验,可以很好地弥补滤膜法在检测过程中的不足。
一、材料和方法
(一)试剂与设备
依据相关方法要求准备相应的试剂与设备。
(二)实验方法
1. 滤膜法
滤膜法检测步骤参照《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》(GB 8538—2016)进行检测。
2. 酶底物法
酶底物法检测步骤参照《包装饮用水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法》(T/HBFIA 0026—2021)进行检测。
3. 定量质控检测
NSI定量质控菌株从-10℃冰箱取出,首先在室温下平衡温度10min—15min,随后将质控菌株转移入预先准备好的250mL无菌磷酸缓冲液中,轻轻振荡,直至质控菌株完全溶解。注意水合作用30min内完成检测。
二、实验结果分析和讨论
(一)方法精密度
目前,铜绿假单胞菌国内检测标准是《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》(GB 8538—2016),此方法为滤膜法,但在实际应用中存在检测周期长、操作过程复杂等局限性。我公司第一个成功申请并发布的团体标准《包装饮用水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法》(T/HBFIA 0026—2021),可在24h内定性或定量检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌,操作简单,无需确认实验,可以很好地弥补滤膜法在检测过程中的不足。
一、材料和方法
(一)试剂与设备
依据相关方法要求准备相应的试剂与设备。
(二)实验方法
1. 滤膜法
滤膜法检测步骤参照《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》(GB 8538—2016)进行检测。
2. 酶底物法
酶底物法检测步骤参照《包装饮用水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法》(T/HBFIA 0026—2021)进行检测。
3. 定量质控检测
NSI定量质控菌株从-10℃冰箱取出,首先在室温下平衡温度10min—15min,随后将质控菌株转移入预先准备好的250mL无菌磷酸缓冲液中,轻轻振荡,直至质控菌株完全溶解。注意水合作用30min内完成检测。
二、实验结果分析和讨论
(一)方法精密度
选择中国工业菌种保藏中心(CICC)的铜绿假单胞菌菌株,溯源信息为CICC21636,按照厂家提供的制备方法,将其稀释至适宜的浓度制备成高、中、低3种浓度的人为污染样品,使用酶底物法进行测定铜绿假单胞菌,每个浓度分别重复测定7次。为了使检测结果呈正态分布,将检测结果作对数处理后再进行方法精密度的计算,结果表明:高、中、低3种浓度样品的实验室内相对标准偏差分别为1.3%、0.8%和9.0%。酶底物法检测高、中、低不同浓度样品的实验室内相对标准偏差均在10%以内,方法的稳定性很高。
(二)方法正确度
选择NSI铜绿假单胞菌定量质控(批号:210414,真值范围168±24MPN/250mL),使用酶底物法进行铜绿假单胞菌的测定,重复进行6次测定。将结果与定量质控的真值范围进行比较,所有6组结果均在定量质控的真值范围内,合格率为100%。为进一步评价酶底物法检测铜绿假单胞菌结果的正确度,将检测结果作对数处理使其满足正态分布后,再进行方法正确度的计算。结果表明:方法正确度相对误差为0.8%,说明酶底物法测定铜绿假单胞菌的结果非常可靠、准确。
(三)排他性试验
考虑到荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌均为假单胞菌属,而大肠埃希氏菌菌株在市场上普遍存在,较为容易购买,所以选择荧光假单胞菌(CICC 21620)、恶臭假单胞菌(CICC 20544)和大肠埃希氏菌(CICC 23657)3种菌株作为铜绿假单胞菌的阴性菌进行排他性试验。
按照厂家说明书将标准菌株复苏传代后,将其配置成浓度为1×103-105CFU/250mL的菌悬液,随后使用酶底物法进行检测,每种菌的每个浓度测定3次,3个浓度共计测定9次,所有孔格在培养24h后均未出现荧光,测定结果均为阴性。说明酶底物法测定铜绿假单胞菌同样具备很高的特异性。
(四)加标水样与滤膜法的比较
使用铜绿假单胞菌有证标准物质(NCTC 12951),制备成高、中、低3种浓度的人为污染水样,其范围分别为:低(浓度为1-10MPN/250mL)、中(浓度为50-100MPN/250mL)和高(浓度为500-1500MPN/250mL),用酶底物法(T/HBFIA 0026—2021)和滤膜法(GB 8538—2016) 对其进行检测,其中低浓度36组,中浓度50组,高浓度33组。为进一步探究两种方法在检测样品时是否存在差异性,运用SPSS Statistics软件对滤膜法和酶底物法的3组检测结果进行t检验分析,为了使检测结果呈正态分布,将检测结果作对数处理后再进行t检验分析,低浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.203(>0.05),中浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.253(>0.05),高浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.228(>0.05),说明两种检测方法的3种不同浓度检测结果无显著差异,具有高度一致性。可认为滤膜法和酶底物法均可有效检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌。
(五)酶底物法与滤膜法综合比较
从培养基、检测周期、结果读数、操作步骤等方面对两种检验方法进行了综合比较分析。滤膜法测定包装饮用水中铜绿假单胞菌所需用到的培养基和试剂包括CN琼脂、金氏培养基、乙酰胺肉汤、营养琼脂、氧化酶制剂和纳氏试剂,其中乙酰胺具有刺激性且可致癌、纳氏试剂中的碘化汞同样为剧毒药品,培养基和试剂成分对人体的危害较大,酶底物法所用培养基和试剂基本为无毒。同时,酶底物法可以直接在24h内出结果,无需确认实验,而滤膜法的检测周期则需要48h—7d,检测步骤也相对较为复杂。从结果读数来讲,酶底物法可直接通过365nm紫外灯判读所有发荧光的孔格,判断为铜绿假单胞菌的阳性,而滤膜法则需要人为进行菌落计数,误差相对较大。由此可见,酶底物法在检验周期、培养基、操作过程等方面较滤膜法有明显优势。
三、结论
酶底物法测定包装饮用水中铜绿假单胞菌在国内外都有相关标准认证,具有操作便捷、检测周期短、无需确认实验、结果读数简单等特点,可以作为滤膜法的一个很好补充。特别是在检测大批量样品或者应急检测时,较滤膜法有非常大的优势。作为滤膜法的补充,酶底物法将成为一种发展趋势,未来有可能替代滤膜法,成为主流的包装饮用水中铜绿假单胞菌测定方法。 (王 静)
(二)方法正确度
选择NSI铜绿假单胞菌定量质控(批号:210414,真值范围168±24MPN/250mL),使用酶底物法进行铜绿假单胞菌的测定,重复进行6次测定。将结果与定量质控的真值范围进行比较,所有6组结果均在定量质控的真值范围内,合格率为100%。为进一步评价酶底物法检测铜绿假单胞菌结果的正确度,将检测结果作对数处理使其满足正态分布后,再进行方法正确度的计算。结果表明:方法正确度相对误差为0.8%,说明酶底物法测定铜绿假单胞菌的结果非常可靠、准确。
(三)排他性试验
考虑到荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌均为假单胞菌属,而大肠埃希氏菌菌株在市场上普遍存在,较为容易购买,所以选择荧光假单胞菌(CICC 21620)、恶臭假单胞菌(CICC 20544)和大肠埃希氏菌(CICC 23657)3种菌株作为铜绿假单胞菌的阴性菌进行排他性试验。
按照厂家说明书将标准菌株复苏传代后,将其配置成浓度为1×103-105CFU/250mL的菌悬液,随后使用酶底物法进行检测,每种菌的每个浓度测定3次,3个浓度共计测定9次,所有孔格在培养24h后均未出现荧光,测定结果均为阴性。说明酶底物法测定铜绿假单胞菌同样具备很高的特异性。
(四)加标水样与滤膜法的比较
使用铜绿假单胞菌有证标准物质(NCTC 12951),制备成高、中、低3种浓度的人为污染水样,其范围分别为:低(浓度为1-10MPN/250mL)、中(浓度为50-100MPN/250mL)和高(浓度为500-1500MPN/250mL),用酶底物法(T/HBFIA 0026—2021)和滤膜法(GB 8538—2016) 对其进行检测,其中低浓度36组,中浓度50组,高浓度33组。为进一步探究两种方法在检测样品时是否存在差异性,运用SPSS Statistics软件对滤膜法和酶底物法的3组检测结果进行t检验分析,为了使检测结果呈正态分布,将检测结果作对数处理后再进行t检验分析,低浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.203(>0.05),中浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.253(>0.05),高浓度滤膜法和酶底物法中的t检验P=0.228(>0.05),说明两种检测方法的3种不同浓度检测结果无显著差异,具有高度一致性。可认为滤膜法和酶底物法均可有效检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌。
(五)酶底物法与滤膜法综合比较
从培养基、检测周期、结果读数、操作步骤等方面对两种检验方法进行了综合比较分析。滤膜法测定包装饮用水中铜绿假单胞菌所需用到的培养基和试剂包括CN琼脂、金氏培养基、乙酰胺肉汤、营养琼脂、氧化酶制剂和纳氏试剂,其中乙酰胺具有刺激性且可致癌、纳氏试剂中的碘化汞同样为剧毒药品,培养基和试剂成分对人体的危害较大,酶底物法所用培养基和试剂基本为无毒。同时,酶底物法可以直接在24h内出结果,无需确认实验,而滤膜法的检测周期则需要48h—7d,检测步骤也相对较为复杂。从结果读数来讲,酶底物法可直接通过365nm紫外灯判读所有发荧光的孔格,判断为铜绿假单胞菌的阳性,而滤膜法则需要人为进行菌落计数,误差相对较大。由此可见,酶底物法在检验周期、培养基、操作过程等方面较滤膜法有明显优势。
三、结论
酶底物法测定包装饮用水中铜绿假单胞菌在国内外都有相关标准认证,具有操作便捷、检测周期短、无需确认实验、结果读数简单等特点,可以作为滤膜法的一个很好补充。特别是在检测大批量样品或者应急检测时,较滤膜法有非常大的优势。作为滤膜法的补充,酶底物法将成为一种发展趋势,未来有可能替代滤膜法,成为主流的包装饮用水中铜绿假单胞菌测定方法。 (王 静)